Основан по челобитной монахинь разрушенного литовцами Введенского монастыря новгородским митрополитом Корнилием в г. Великие Луки в 1675 г. на месте упразднённого в 1632 г. Ильинского мужского монастыря. Первые постройки монастыря были деревянными и при пожаре в 1719 г. сгорели. С 1724 г. началось строительство каменных зданий. В 1750 г. была построена каменная Вознесения Господня церковь с двумя приделами: Святого Пророка Ильи и Святых Благоверных князей Бориса и Глеба.

Согласно именному, данному Синоду, указу от 6 мая 1788 г. «О разделении епархий сообразно с разделением губерний» Вознесенский монастырь перешёл из Новгородской епархии в Псковскую.

В 1868 г. в двух верстах от города была построена принадлежащая монастырю часовня Священномученика Харлампия и Великомученика Пантелеймона. В 1876 г. к монастырю была приписана городская кладбищенская церковь Казанской иконы Божьей Матери с двумя приделами: Всех Святых и Апостолов Петра и Павла. В 1881 г. рядом с монастырём на средства горожан была поставлена чугунная часовня Александра Невского.

В 1902 г. при монастыре была открыта церковно-приходская школа для девочек.

Монастырь был закрыт в 1918 г., его обитатели выселены. Согласно постановлению Великолукского уисполкома от 24 марта 1924 г. была закрыта Вознесенская церковь. Это было подтверждено решением президиума Псковского губисполкома от 4 июля 1924 г.